На данный момент это огромная отрасль биотехнологии, включающая все методы модификации и переноса генов от одних организмов другим.

Некоторые понятия, используемые в генной инженерии:

  1. Вектор – ДНК, в которую встраивают новый фрагмент для переноса в другую клетку. В качестве вектора часто используют вирусную ДНК (ДНК фагов), так как в нее можно встроить более длинные участки, чем в бактериальные векторы, также способные переносить чужеродную ДНК. Векторы являются посредниками между донорами и реципиентами ДНК.
  2. Организм-донор «предоставляет» свою ДНК.
  3. Организм-реципиент (акцептор) «принимает» чужеродную ДНК, меняя свой геном.

 

Рестриктазы

Основными инструментами генной инженерии являются ферменты. Некоторые ферменты разрезают молекулу ДНК в строго определенном месте (считывает определенные последовательности и разрезает молекулу между конкретными для этого фермента нуклеотидами). Такие ферменты называются рестриктазами.

Другие ферменты сшивают разобщенные фрагменты ДНК друг с другом. Такие ферменты называют лигазами.

Рестриктазы в основном катализируют разрушение связей в молекуле ДНК определенных вирусов, например, фагов. Они узнают участки, имеющие структуру палиндромов, и разрезают их.

 

Как образуются липкие концы

Как образуются липкие концы

Рис. Ферменты рестрикции. При рестрикции могут образовываться «липкие» и «тупые» концы. Липкие концы имеют одноцепочечные последовательности нуклеотидов.

Разрушение фаговой ДНК спасает бактерию от паразитирования на ней вируса. Именно это свойство приметили инженеры и используют рестриктазы для получения ДНК с липкими концами. Интересно, что рестриктазы встречаются только в тех клетках бактерий, в которых есть другие ферменты – метилазы, они метилируют те нуклеотиды собственной ДНК бактерии, на которые действуют рестриктазы, из-за чего рестриктаза не может с ними связываться и соответственно, разрушать ДНК бактерии. Таким образом, бактерия спасается от внедрения вирусной ДНК с помощью рестриктаз, а с помощью метилаз защищает собственную ДНК от собственных же рестриктаз.

Формирование липких концов на ДНК

Рис. Работа рестриктазы, образование липких концов

Как образуются липкие концы

Задачи генной инженерии

Основная задача генной инженерии – получение организмов с измененным генетическим материалом в лабораторных условиях.

Генная инженерия обеспечивает ряд важных потребностей человека:

  1. Получение гормонов вне организма человека (инсулин, гормон роста, гормоны щитовидной железы).
  2. Получение интерферона.
  3. Получение кормового белка.
  4. Разработка методов генной терапии для лечения некоторых генных заболеваний, например, гемофилии А.
  5. Получение вакцин.
  6. Благодаря методам генной инженерии стало возможным переносить гены между организмами, которые не способны скрещиваться, так, например, можно перенести ген устойчивости к некоторым видам паразитов от одного растения другому, что позволит получать более высокий урожай и не применять при выращивании таких растений яды. Такие организмы называют генетически модифицированными (ГМО).

Получение фрагментов ДНК (генов)

Для осуществления работы над геном его нужно сначала выделить или получить любым другим путем. Одним из методов получения гена является обратная транскрипция на матрице синтезированной в клетке иРНК. Напомним, что транскрипция происходит по принципу комплементарности и новая иРНК образуется на матрице ДНК (на фрагменте, который как раз называют геном). Таким образом, иРНК несет ту же информацию, что содержит ген, только на своем «языке». И раз на матрице ДНК по принципу комплементарности можно синтезировать иРНК, то и обратный процесс тоже возможен. Процесс обратной транскрипции осуществляется ферментом обратной транскриптазой (ревертазой). Так, на матрице одной иРНК можно создать множество копий ДНК.

Обратные транскриптазы очень важны для ретровирусов. Эти вирусы хранят генетическую информацию в молекуле РНК, а не ДНК. Чтобы встроить свой генетический материал в клетку хозяина, его нужно сначала преобразовать в двуцепочечную молекулу ДНК. Самым известным ретровирусом является вирус иммунодефицита человека – ВИЧ.

 

Обратная транскриптаза

Рис. Получение фрагмента ДНК обратной транскрипцией. На схеме показан фрагмент ДНК, характерный для прокариот, не содержащих интронов.

Перенос генов в клетку

Для переноса выделенного гена в клетку другого организма существует несколько методов:

  1. Трансформация – перенос генов в составе исходной ДНК.
  2. Трансдукция – перенос генов с помощью вирусов.
  3. Гибридизация – объединение клеток, выделенных из разных организмов.

Далее мы будем рассматривать первые два метода.

  1. Перенос генов из ДНК человека в бактериальную плазмиду.

Этот метод позволил получить штаммы бактерий, производящие некоторые человеческие белки. Почему используют именно плазмиды? Плазмиды — это небольшие кольцевые последовательности ДНК, в них часто можно встретить «дополнительные» гены, например, гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (ампициллин, тетрациклин). Значительным плюсом плазмид является их сравнительно небольшой размер. Благодаря этому последовательность нуклеотидов в плазмидах легче расшифровать и проще управлять процессами, необходимыми для реализации генетического материала. Но есть у плазмид и минусы – они не могут «принять» длинные последовательности чужеродной ДНК, следовательно, плазмиды используют для встройки небольших фрагментов ДНК, а химерная бактерия продуцирует небольшой полипептид, например, инсулин.

Встраивание ДНК человека в ДНК бактерии

Рис. Встраивание фрагмента ДНК человека в бактериальную плазмиду

 

  1. Трансдукция

Последовательность получения химерного организма с использованием вирусного вектора (для упрощения формулировок будем использовать следующие понятия: организм-донор «предоставляет» свою ДНК для переноса в другие организмы; организм-акцептор или организм-реципиент «принимает» чужеродную ДНК, изменяя свои свойства; вектор – посредник между донором и акцептором, облегчающий соединение их ДНК):

  1. Выбор организма-донора и подбор организма-акцептора.
  2. Выбор подходящего вектора. В данном случае это ДНК вируса.
  3. Выделение молекул ДНК организма-донора и вирусного вектора.
  4. Обработка их одной и той же рестриктазой.
  5. Образование на обеих молекулах липких концов.
  6. Смешивание фрагментов ДНК организма-донора и ДНК вируса, соединение их по липким концам.
  7. Использование ДНК-лигаз для образование фосфодиэфирных связей между цепями ДНК донора и вируса.
  8. Формирование вирусной частицы, содержащей фрагмент ДНК донора.
  9. Заражение клеток организма-акцептора данным вирусом.
  10. Встраивание в ДНК организма-акцептора вирусной ДНК вместе с ДНК организма-донора.
  11. Формирование клеток с химерной ДНК, их преобразование (новые гены меняют свойства клеток).
  12. Отбор клеток с измененным генотипом (не все клетки инфицируются вирусом)
  13. Создание культуры клеток, имеющих желаемый набор генов.

Вирусные векторы используются в тех случаях, когда нужно перенести большой фрагмент ДНК. Например, из одного организма в другой.

Задания репродуктивного характера

Для их выполнения вам потребуется внимательно прочитать текст, рассмотреть схемы и подписи к ним.

Выберите верные суждения:

  1. Рестриктазы универсальны, одну рестриктазу можно использовать для разрезания разных последовательностей нуклеотидов.
  2. Перенос ДНК можно осуществить только с помощью вирусного вектора.
  3. Лигазы помогают восстановить целостность ДНК.
  4. В качестве вирусных векторов используют вирус иммунодефицита человека, легко проникающий в клетку хозяина, если необходимо доставить ДНК клеткам человека.
  5. Плазмида – основная молекула ДНК вируса.
  6. Рестриктазы обнаруживаются в клетках бактерий.
  7. Не все бактериальные клетки имеют рестриктазы.
  8. Геном прокариот не содержит интроны – не кодирующие участки ДНК.
  9. Бактериальные векторы, например, плазмиды, могут переносить более длинные фрагменты ДНК, чем вирусные векторы.
  10. Обратная транскриптаза участвует в образовании ДНК на матрице иРНК.
  11. Инсулин получают методами генной инженерии.
  12. Некоторые ферменты способны образовывать «тупые» концы, они не содержат одноцепочечных участков.
  13. Рестриктазы узнают палиндромные участки на ДНК.

Задания с развернутым ответом

Задание 1

Известно, что при встраивании в бактериальный вектор (в плазмиду) нового фрагмента ДНК свойства внесенной ДНК не меняются, а свойства бактериальной ДНК могут измениться, следовательно, меняется и её обмен веществ. Так, некоторые бактерии после внесения в их плазмиды новой последовательности ДНК могут потерять свою устойчивость к антибиотикам. Предположите, почему?

Задание 2

Почему полученная при обратной транскрипции ДНК не содержит интроны, если исходная ДНК содержала?

Задание 3

Известно, что практически все клетки человека содержат полный набор генов. Однако, не во всех клетках удается обнаружить интересующую исследователя мРНК, чтобы путем обратной транскрипции получить фрагмент гена. Как это можно объяснить? Вопрос-подсказка: почему этим методом невозможно выделить ген, отвечающий за синтез пепсина, если была использована клетка печени?

Задание 4

До получения инсулина методами генной инженерии больным сахарным диабетом вводили инсулин других животных, например, инсулин свиньи. Он оказался менее эффективным, чем инсулин человека, почему?

Литература

Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: Учебник.– 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.– 704 с.: ил.– (Учеб. лит. Для студентов мед. вузов).

Биохимия и молекулярная биология/ В. Эллиот, Д. Эллиот; Под ред. А. И. Арчакова, М. П. Кирпичниова, А. Е. Медведева. В. П. Скулачева; Пер. с англ. О. В. Добрыниной, И. С. Севериной, Е. Д. Скоцеляс и др. – М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002.

Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1993.

Наглядная биотехнология и генетическая инженерия [Электронный ресурс] / Р. Шмид; пер. с нем.  2-е изд. (эл.). – Электрон. текстовые дан. (1 файл pdf: 327 с.). – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015.

Ответы

Ответы к заданиям и их разбор доступны только для донов групп ВК BioChem или Методические посиделки: Биология и химия.